果蔬可溶性蛋白质含量（Solubleproteincontent）是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白质是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。此外，在研究每一种酶的作用时常以比活力（酶活力单位/毫克蛋白质，Unit/mgProtein)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，就需要经常测定可溶性蛋白质的含量。
I．考马斯亮蓝染色法
一、目的要求
了解考马斯亮蓝染色法测定果蔬组织中可溶性蛋白质含量的原理，掌握测定方法。
二、基本原理
考马斯亮蓝G-（CoomassiebrilliantblueG-）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度的方法。该燃料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大吸光在nm，后者在nm。在一定的蛋白质浓度范围（1~μg）内，蛋白质与该染料结合物在nm波长下的吸光度值与蛋白质含量成正比，符合比尔定律，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G-和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与染料结合状况有差异。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
各种水果和蔬菜。
（二）仪器及用具
离心机、分光光度计、移液器、研钵、离心管、旋涡混合器、烧杯、容量瓶（mL，mL）、具塞刻度试管（20mL）。
（三）试剂
1．标准蛋白质溶液（μg/mL牛血清蛋白质）
称取25mg牛血清蛋白质，加水溶解并定容至mL。吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至mL即可。
2．考马斯亮蓝G-溶液
称取mg考马斯亮蓝G-，溶于50mL90%乙醇中，再加入mL85%（w/v）的磷酸，混合摇溶。将混合液转移到mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释、定容至刻度。贮于棕色瓶中，常温下可保存1个月。如有沉淀，可过滤后使用。
四、实验步骤
（一）制作标准曲线
取6支具塞试管，编号，并按表8加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各试管中加入5.0mL考马斯亮蓝G-溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。混合后静置2min后，以0号试管为空白对照，用1cm光径的比色皿在nm下比色测定吸光值。以蛋白质微克数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。
表8.考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量绘制标准曲线的各试剂加入量
（二）提取
称取2.0g果蔬样品组织，加入5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，于4℃、×g离心20min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用。
（三）测定
吸取1.0mL样品提取上清液（视蛋白含量适当稀释），放入具塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-溶液，充分混合，放置2min后在波长nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度值。重复三次。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
根据溶液吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质微克数，计算果蔬组织中可溶性蛋白质含量，以每克果蔬组织所含可溶性蛋白质的毫克数表示，即mg/gFW。计算公式：
式中：
C——从标准曲线查得的蛋白质的量，μg；
V——样品提取液总体积，mL；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
W——样品重量，g。
六、注意事项
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（如同0.1mol/L的酸干扰Lowary法一样）。
（）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用比尔定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
II．紫外吸收法
一、目的要求
了解紫外吸收法测定果蔬组织中可溶性蛋白质含量的原理及其应用。
二、基本原理
蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。蛋白质吸收高峰在nm处，其吸光度值与蛋白质含量成正比，因此，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。另外，由于蛋白质吸收高峰常因溶液pH的改变而有所变化，因此测定时要注意使溶液的pH与标准蛋白质的溶液pH相一致。
利用紫外吸收法测定蛋白质浓度，可将蛋白质浓度控制在0.1~1mg/mL左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/mL的蛋白质溶液时，nm吸光度值约为1.0左右，由此也可立即计算出蛋白质的大致浓度。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
各种水果和蔬菜。
（二）仪器及用具
离心机、紫外分光光度计、移液器、研钵、离心管、旋涡混合器、容量瓶（mL，mL）、具塞刻度试管（20mL）。
（三）试剂
标准蛋白质溶液（1mg/mL牛血清蛋白质）：称取50mg牛血清蛋白质，加水溶解、定容至50mL即可。
四、实验步骤
（一）标准曲线的绘制
取7支试管，编号，按表9分别加入各种试剂，摇匀。选用光径1cm的石英比色杯，已0号管为空白对照，在nm波长处分别测定各管溶液的吸光度值（OD）。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标制作标准曲线应为直线，求得线性回归方程。
表9.紫外吸收法测定可溶性蛋白含量绘制标准曲线各试剂加入量
（二）提取
同考马斯亮蓝法中果蔬可溶性蛋白质提取方法。
（三）测定
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取nm的吸光度值，根据标准曲线即可查出溶液的蛋白质含量，计算果蔬样品中蛋白质的含量。
五、注意事项
1．核酸紫外吸收高峰在nm附近，而且，核酸对波长在nm的紫外光也具有很强的吸收。含有核酸的蛋白质溶液，在利用紫外吸收法测定蛋白质浓度时，能受到核酸的干扰。在实际操作用中，可分别测定待测蛋白质溶液的OD和OD，用下面的经验公式，可计算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×OD－0.74×OD
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
2．也可先计算出OD/OD的比值后，从表10中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。
表10.紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子
注：一般纯蛋白质的光吸收比值（OD/OD）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。
溶液中蛋白质浓度（mg/mL）=F×OD×N
式中：F——校正因子；
OD——溶液在nm下测得的光吸收值；
N——溶液的稀释倍数。
．对于稀蛋白质溶液（蛋白质含量范围20~μg/mL），还可用nm和nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△OD（=OD–OD）与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。氯化钠、硫酸铵以及0.1mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都对此方法无显著干扰作用。但是0.1mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在波长nm处的吸收较大，不能应用。
IV．Lowry法（劳里法）
一、目的要求
掌握利用Lowry法测定果蔬组织中可溶性蛋白质含量的原理和方法。
二、基本原理
Lowry法是双缩脲法和福林酚法（Folin-酚）测定蛋白质含量的结合与发展。
双缩脲法的原理双缩脲（NH2—CO—NH—CO—NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用来测定蛋白质的含量。双缩脲反应主要涉及肽键，受蛋白质特异性影响较小。该方法使用的试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1~10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为与它们能产生阳性呈色反应；铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展。在测定反应过程中，首先是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物。此络合物可将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，混合物呈深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高倍，定量范围为5~μg蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起的，当样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物时，均能干扰测定。此方法的缺点是受蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
Lowry法的原理用碱性铜溶液处理蛋白质溶液后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜-蛋白质的络合盐。在碱性条件下，这种被结合的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易地可将酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸（Phosphomolybdate＆Phosphotungstate）还原，生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅程度与蛋白的含量正相关，可以用于蛋白质含量的测定。Lowry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强～15倍，约是双缩脲法的倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。Lowry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
各种果蔬组织。
（二）仪器与用具
试管、移液器、圆底烧瓶、冷凝管（带橡胶管）、微量滴定管、烧杯、微量进样器、分光光度计、恒温水浴锅、研钵、玻棒、离心机、离心管。
（三）试剂
钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、85%磷酸（85%HPO4）、浓盐酸、硫酸锂（Li2SO4·H2O）、溴水、酚酞指示剂、Na2CO、NaOH、硫酸铜（CuSO4·5H2O）、酒石酸钾钠、牛血清白蛋白。
四、实验步骤
（一）试剂的配制
1．甲液碱性铜试剂（相当于双缩脲试剂）的制备
A液：分别配制mL4%Na2CO溶液和mL0.2mol/LNaOH溶液，将4%碳酸钠（Na2CO）溶液与0.2mol/LNaOH溶液等比例混合即为A液（含2%Na2CO和0.1mol/LNaOH）；
B液：分别配制mL1%CuSO4·5H2O溶液和mL2%酒石酸钾钠溶液，将1%CuSO4·5H2O溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合即为B液（含0.5%CuSO4·5H2O和0.1%酒石酸钾钠）。
在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即为Folin-酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
2．乙液酚试剂（相当于Folin试剂）的制备
称取g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），加mL蒸馏水，溶解后转到1mL的圆底烧瓶中，再加入50mL85%HPO4和mL浓HCl。安装上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入g硫酸锂（Li2SO4·H2O），50mL蒸馏水，2~滴溴水，不用回流装置，开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至mL，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min）。使用前用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后计算出酸的浓度。使用时大约加1倍蒸馏水，使最终浓度相当于1mol/LH+酸，此为Folin-酚试剂乙液。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
．标准蛋白质溶液的配制
称取25mg牛血清白蛋白，溶于mL蒸馏水中，使最终浓度为μg/mL。
（二）标准曲线的绘制
1．取6支试管，编号，按表11分别加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀。
表11.Lowry法测定可溶性蛋白质含量绘制标准曲线各试剂加入量
2．向每支试管中分别加入5.0mL甲液，混匀，于0℃下放置10min。
．再向每支试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在0℃下准确保温0min。
4．保温后，以0号管中的溶液为空白，在波长nm处用1cm光径的比色杯对各管标准蛋白溶液进行比色，测定吸光度值（必要时可做重复）。以吸光度值为纵坐标，蛋白质的微克数为横坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。
（三）提取
称取2.0g果蔬样品，用5.0mL蒸馏水或缓冲液研磨提取，于4℃、×g离心20min，收集上清液，4℃保存备用。
（四）测定
取1.0mL（视蛋白质含量适当稀释）蛋白质提取液加入试管中，然后重复实验操作（二）中的2、和4等步骤。另取一支试管，加入1.0mL蒸馏水或缓冲液代替提取液，进行同样操作，作为空白参比进行调零，分别于波长nm处测定吸光度值。重复三次。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
根据吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质微克数，计算果蔬组织中可溶性蛋白质含量，以每克鲜重果蔬组织所含可溶性蛋白质的毫克数表示，即mg/gFW。计算公式：
式中：
C——从标准曲线查得的蛋白质的量，μg；
V——样品提取液总体积，mL；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
W——样品重量，g。
六、注意事项
1．Folin试剂乙液只在酸性条件下稳定。因此，当其加到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
2．为了保证反应进行完全，反应在25~0℃水浴中进行，准确保温反应0min后比色。
．样品溶液中还原物质、酚类物质及柠檬酸对Lowry法测定蛋白质的反应有干扰。
4．由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。不同书籍选用不同的波长，有选用或nm的，还有选用、、或nm的。在具体实验时，可在预先测定中进行确定测定波长。